大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤 PC-12分化細(xì)胞操作步驟
分化誘導(dǎo)階段
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%-70%匯合時(shí)，更換為含1%馬血清和100ng/ml NGF（神經(jīng)生長因子）的低血清分化培養(yǎng)基。注意保持培養(yǎng)基pH值在7.2-7.4之間，每2天更換新鮮分化培養(yǎng)基。此階段需特別注意：①使用經(jīng)0.1%多聚賴氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)皿增強(qiáng)細(xì)胞貼附；②培養(yǎng)箱濕度維持在95%以避免培養(yǎng)基蒸發(fā)造成的滲透壓變化。
形態(tài)學(xué)觀察
分化第3天起，在倒置相差顯微鏡下可觀察到特征性改變：胞體逐漸伸長，從圓形上皮樣向梭形神經(jīng)元樣轉(zhuǎn)變，并開始伸出細(xì)長突起。建議每日拍攝固定視野的時(shí)序照片，使用ImageJ軟件量化神經(jīng)突長度（≥2倍胞體直徑視為有效突起）。典型分化過程約需7-10天，當(dāng)50%以上細(xì)胞呈現(xiàn)明顯神經(jīng)突時(shí)可判定分化成功。
功能驗(yàn)證
分化完成后可通過以下方法驗(yàn)證：①免疫熒光檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和β-微管蛋白III表達(dá)；②鈣成像檢測細(xì)胞對高鉀溶液的鈣響應(yīng)；③采用微電極陣列（MEA）記錄自發(fā)放電活動(dòng)。注意實(shí)驗(yàn)需設(shè)置未分化細(xì)胞對照組。
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注意事項(xiàng)
1. 嚴(yán)格把控NGF活性：分裝儲(chǔ)存于-80℃，避免反復(fù)凍融
2. 分化期間禁止使用胰蛋白酶消化，需換液時(shí)采用溫和的PBS沖洗
3. 出現(xiàn)過度聚集現(xiàn)象時(shí)，可加入2μM胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷抑制非神經(jīng)元細(xì)胞增殖。
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